Влияние антибиотиков разных групп на возникновение мутационной устойчивости к колистину у Klebsiella pneumoniae

Abstract

Цель. Определить концентрации колистина, предотвращающие селекцию колистинорезистентных мутантов K. pneumoniae, и оценить влияние антибиотиков разных групп на возникновение мутационной устойчивости к колистину. Материалы и методы. Для 88 штаммов K. pneumoniae методом последовательных микроразведений в бульоне определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) колистина и выполнена детекция генов карбапенемаз. Селекция колистинорезистентных субпопуляций проведена на сбалансированном по содержанию катионов агаре Мюллера – Хинтон (МХА) с добавлением 16 мг/л колистина. Минимальная концентрация колистина, предотвращающая селекцию мутаций (mutant prevention concentration, MPC), определена на МХА, содержащем 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 мг/л колистина. Дополнительно определены MPC колистина в присутствии фиксированной концентрации второго антибиотика: кларитромицина (2 мг/л), азитромицина (2 мг/л), рифампицина (1 мг/л), клиндамицина (0,5 мг/л), меропенема (8 мг/л), линезолида (2 мг/л), амикацина (1 мг/л), ванкомицина (2 мг/л), доксициклина (2 мг/л). Результаты. Все штаммы сохраняли чувствительность к колистину (МПК 0,06–1,0 мг/л). Устойчивость к меропенему (МПК > 8 мг/л) выявлена у 48 штаммов (54,5%), из них 46 являлись продуцентами карбапенемаз: KPC – 6 штаммов (6,8%), OXA-48 – 26 штаммов (29,5%), NDM – 14 штаммов (15,9%). Рост колоний на МХА с 16 мг/л колистина наблюдался для 96,6% штаммов, частота возникновения мутационной устойчивости составила от 6 × 10-9 до 10-6 (медиана 2 × 10-7). Мутационная природа устойчивости к колистину подтверждена для 36,4% штаммов. Значения MPC колистина находились в диапазоне 16–256 мг/л (MPC50 32 мг/л, MPC90 256 мг/л) и значительно (в 32–1024 раза) превосходили значения МПК. В присутствии 1 мг/л рифампицина MPC колистина снижались в 4–64 раза (MPC50 4 мг/л, MPC90 4 мг/л). В присутствии 2 мг/л доксициклина MPC колистина снижались в 2–64 раза для всех штаммов (MPC50 8 мг/л, MPC90 16 мг/л). Присутствие линезолида (2 мг/л) и ванкомицина (2 мг/л) значимо не изменяло MPC колистина. Меропенем в концентрации 8 мг/л не оказывал значимого влияния на MPC колистина для карбапенемазопродуцирующих штаммов K. pneumoniae. Ни один из антибиотиков не снижал MPC50 колистина до его клинически достижимых сывороточных концентраций. Выводы. Выявлена высокая частота формирования мутационной устойчивости к колистину у K. pneumoniae. Значения MPC колистина находятся за пределами его клинически достижимых сывороточных концентраций и могут снижаться в присутствии других антибиотиков.

Objective. To determine the concentration of colistin, preventing the selection of colistin-resistant mutants of K. pneumoniae, and to evaluate the effect of antibiotics of different groups on the development of mutational resistance to colistin. Materials and methods. Minimum inhibitory concentrations (MIC) of colistin were determined for 88 K. pneumoniae strains by the method of serial microdilutions in broth, and carbapenemase genes were detected. The selection of colistin-resistant subpopulations was performed on cation-adjusted Müller-Hinton agar (MHA) with the addition of 16 mg/l colistin. Mutant prevention concentration (MPC) of colistin is determined on MHA containing 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 and 128 mg/l of colistin. Also, MPCs of colistin were determined in the presence of a fixed concentration of the second antibiotic: clarithromycin (2 mg/l), azithromycin (2 mg/l), rifampicin (1 mg/l), clindamycin (0.5 mg/l), meropenem (8 mg/l), linezolid (2 mg/l), amikacin (1 mg/l), vancomycin (2 mg/l), doxycycline (2 mg/l). Results. All strains remained susceptible to colistin (colistin MIC 0.06-1.0 mg/l). Resistance to meropenem (MIC > 8 mg/l) was detected in 48 strains (54.5%), 46 of them were carbapenemase producers: KPC - 6 strains (6.8%), OXA-48 - 26 strains (29.5%), NDM - 14 strains (15.9%). Growth of colonies on MHA with 16 mg/l of colistin was found for 96.6% of the strains. The frequency of mutational resistance occurrence ranged from 6 × 10-9 to 10-6 (median: 2 × 10-7). The mutational nature of colistin resistance was confirmed for 36.4% of the strains. The MPC values of colistin were in the range of 16-256 mg/l; (MPC50 32 mg/l, MPC90 256 mg/l) and significantly (32-1024 times) exceeded the MIC values. In the presence of 1 mg/l of rifampicin, the MPC of colistin decreased 4-64 times (MPC50 4 mg/l, MPC90 4 mg/l). In the presence of 2 mg/l of doxycycline, MPC of colistin decreased 2-64 times for all strains (MPC50 8 mg/l, MPC90 16 mg/l). The presence of linezolid (2 mg/l) and vancomycin (2 mg/l) did not significantly change MPC of colistin. Meropenem at a concentration of 8 mg/l had no significant effect on colistin MPC for carbapenemase-producing K. pneumoniae strains. None of the antibiotics lowered the MPC50 of colistin to its clinically achievable serum concentrations. Conclusions. A high frequency of formation of mutational resistance to colistin in K. pneumoniae was revealed. The MPC values of colistin are outside the range of clinically achievable serum concentrations and may decrease in the presence of other antibiotics.